Değişik gelişim dönemlerinde bulunan hibrit fare embriyolarının vitrifikasyon yöntemiyle dondurulması

Abstract

Bu çalışmanın amacı, morula ve blastosist aşamasındaki fare embriyolarının vitrifikasyonla dondurulmasında vitrifikasyon solüsyonu 3 (VS3) ve etilen glikol (EG) vitrifikasyon solüsyonlarının etkinliğini karşılaştırmaktır. Embriyolar ya 10 dakika süreyle 1.625 M gliserol + %1.5 polietilen glikol (PEG) içeren %25 VS3 içerisinde ya da 2 dakika süreyle 2 M etilen glikol (EG) + %10 fötal buzağı serumu (FCS) içerisinde oda ısısında ekilibre edilmiştir. Vitrifikasyon için M2 vasatı içerisinde hazırlanmış %100 VS3 (6.5 M gliserol + %6 PEG) veya 7 M EG solüsyonları kullanılmıştır. %25 VS3 içerisinde ekilibre edilen embriyolar %100 VS3 içerisine transfer edilmiş ve orada 30 saniye süre ile bekletilmiştir. Daha sonra, embriyolar 0.25 ml'lik payetler içerisine aktarılmıştır. Payetler yaklaşık 1 dakika süreyle sıvı azot buharında bekletilmiş ve sonrasında zaman geçirmeden sıvı azot içerisine daldırılmıştır. İki M EG + %10 FCS içerisinde ekilibre edilen embriyolar 7 M EG içerisine transfer edilmiş ve orada 2 dakika süre ile bekletilmiştir. Daha sonra, embriyolar 0.25 ml'lik payetler içerisine aktarılmış ve payetler yaklaşık 1 dakika sıvı azot buharında bekletildikten sonra sıvı azot içerisine daldırılmıştır. Her iki gruptaki embriyolar 25°C'deki sıcak su banyosunda 20 saniye bekletilerek çözündürülmüş ve M2 içerisinde hazırlanan 1 M'lık sükroz solüsyonu içersine aktarılarak 5 dakika süreyle bekletilmiştir. Daha sonra embriyolar 24-48 saat süreyle yüksek nemli, %5 CO2 ve 37°C'lik etüv şartlarında CZB kültür vasatı içerisinde kültüre edilmiştir. VS3 ve EG içerisinde vitrifiye edilen morukların gelişim oranlan (sırasıyla %71.42 ve %28.97), VS3 ve EG içerisinde vitrifiye edilen blastosistlerin gelişim oranlarından (sırasıyla %4.76 ve %3. 12) daha yüksek bulunmuştur. VS3 ve EG içerisinde vitrifiye edilen morula dönemindeki embriyoların gelişim oranları arasındaki fark önemli bulunmuştur (sırasıyla 80/1 12, %71.42 ve 31/107, %28.97; P<0.001). Bununla birlikte, VS3 ve EG içerisinde vitrifiye edilen blastosist dönemindeki embriyoların gelişim oranları arasında önemli bir fark bulunmamıştır (sırasıyla 5/105, %4.76 ve 3/96, %3.12; P>0.05). Sonuç olarak, iki embriyonik gelişim dönemi açısından, morula dönemindeki embriyoların vitrifikasyon işlemine blastosist dönemindeki embriyolara oranla daha iyi dayandığı ve morula dönemindeki embriyoların vitrifikasyon işlemi için VS3 vitrifikasyon yönteminin EG vitrifikasyon yönteminden daha üstün olduğu sonucuna varılmıştır. Bu nsonuçlara göre, fare embriyolarının başarılı kriyoprezervasyonu için morula dönemindeki embriyoların VS3 vitrifikasyon yöntemiyle dondurulması önerilebilir.

Cryopreservation of hybrid mouse embryos at different developmental stages by vitrification method The purpose of this study was to compare the efficiency of two media, VS3 (vitrification solution 3) and EG (ethylene glycol) vitrification media) on the vitrification of morula and blastocyst stage mouse embryos. Embryos were equilibrated either for 10 minutes in 25% VS3 containing 1.625 M glycerol +1.5% polyethylene glycol (PEG) or for 2 minutes in 2 M ethylene glycol, EG + 10% fetal calf serum, FCS at room temperature. For vitrification either 100% VS3 (6.5 M glycerol + 6% PEG) or 7 M EG in M2 was used. Embryos equilibrated in 25% VS3 were transferred into 100% VS3 and held there for 30 seconds. Then, they were loaded into 0.25 ml straws. After that, straws were held in liquid nitrogen vapor for approximately 1 minute and then immediately plunged into liquid nitrogen. Embryos equilibrated in 2 M EG + 10%) FCS were transferred into 7 M EG and held there for 2 minutes. After this, they were loaded into 0.25 ml straws. Then, straws were held in liquid nitrogen vapor for about 1 minute and then immediately plunged into liquid nitrogen. Embryos from both groups were thawed in a 20°C water bath for 20 seconds, transferred to 1 M sucrose in M2 for 5 minutes and then cultured for 24 to 48 hours in CZB medium at 37°C in 5% CO2 in highly humidified air. Survival rates of morula stage embryos vitrified in both VS3 (71.42%) and EG (28.97%) was found higher than those of blastocyst stage embryos vitrified in both VS3 (4.76%) and EG (3.12%). There was a significant difference between the survival rates of morula stage embryos vitrified in VS3 and EG (80/1 12, 71.42% and 31/107, 28.97%, respectively; P<0.001). However, no difference was found between the survival rates of blastocyst stage embryos vitrified in VS3 and EG (5/105, 4.76% and 3/96, 3.12%, respectively; P>0.05). As a result, it was concluded that, of the 2 developmental stages, morula withstand the vitrification better, and vitrification using VS3 procedure was found more superior than vitrification using EG in terms of morula vitrification. According to these results, vitrification of morula stage mouse embryos with VS3 vitrification procedure could be suggested for successful cryopreservation of mouse embryos.